La Casa de Contratación fue una institución fundada en 1503 por orden de Isabel la Católica, encargada de gestionar todo lo relacionado con la navegación y explotación comercial de los nuevos territorios de la Corona en ultramar.
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Inicialmente se asentó en un espacio de las antiguas Atarazanas, pero ante las constantes crecidas del río, se trasladó pronto al emplazamiento que ocuparía en el interior del Alcázar. Allí ocuparía el espacio de uno de los antiguos palacios musulmanes, al Oeste del palacio de Pedro I, espacio que ya venía siendo utilizado por el llamado Cuarto de los Almirantes. A principios del siglo XVI se inició una reforma completa de las instalaciones y se abrió una nueva fachada hacia la actual plaza de la Contratación. Sin embargo, el edificio que hoy podemos ver allí, propiedad de la Junta de Andalucía, se construyó en los años 70 del siglo XX. Fue entonces cuando se reconstruyó el antiguo patio del palacio musulmán, a partir de los escasos restos arqueológicos hallados.
De la Casa de Contratación del siglo XVI se conservaron algunas estancias y patios que hoy son visitables desde el interior del Alcázar. Entre ellas, se pueden destacar el Salón del Almirante y la Sala de Audiencias.
El Salón del Almirante es una amplio espacio de planta rectangular cubierto por un techo de madera, con vigas horizontales que descansan en ménsulas con un diseño inspirado en la obra de Sebastiano Serlio. Datado a finales del siglo XVI, este techo se adscribe al maestro carpintero del Alcázar, Martín Infante. Los muros se hallan decorados con pinturas de los siglos XIX y XX pertenecientes a Patrimonio Nacional, el Museo del Prado y la colección de la Familia Real. Particularmente interesantes son los retratos pintados por el alemán Winterhalter de El rey y la reina de Francia, Luis Felipe y Amelia, con sus hijos, y los de Don Antonio y doña Luisa Fernanda, duques de Montpensier.
Enfrente, cuelga una gran pintura titulada Las postrimerías de Fernando III el Santo, firmada y datada en Sevilla por el pintor local Virgilio Mattoni en 1887. Es una obra propiedad del Museo del Prado, aunque se encuentra depositada en el Alcázar por la gran vinculación de la obra con este lugar, ya que el hecho que narra, la muerte de Fernando III, sucedió aquí, en el Alcázar. En el muro del fondo, en el lugar central de la sala, podemos ver el óleo titulado La inauguración de la Exposición Iberoamericana, pintado por Alfonso Grosso en 1929.
Por su parte, la Sala de Audiencias debe su nombre a que fue sede del Tribunal del Almirantazgo de Castilla. Se trata de una sala de planta cuadrada, cuyo artesonado de madera del siglo XVI, ricamente dorado, presenta trazas que recuerdan al viejo estilo mudéjar.
En los muros aparecen los escudos de armas de varios almirantes célebres en la historia naval de España, entre los que se encuentra el de Cristóbal Colón, justo en el centro del muro de la izquierda.
En la parte central de la habitación vemos el retablo de Nuestra Señora de los Navegantes, realizado por Alejo Fernández en 1535. Es la primera pintura en Europa que tiene como tema el descubrimiento de América. No podemos identificar a las figuras que aparecen con claridad, pero sabemos que están Cristóbal Colón, en el emperador Carlos, Fernando el Católico, Sancho de Matienzo (primer tesorero de la Casa de Contratación), Americo Vespuccio, Juan de la Cosa y varios indígenas, de las tierras recientemente descubiertas. Todos ellos cubiertos bajo el manto de la Virgen de los Buenos Aires. En la parte inferior aparecen varios de los tipos de embarcaciones que hacía la carrera de Indias, por lo que la obra en su conjunto ofrece un testimonio de incalculable valor.